Qual o aumento mínimo necessário para visualização das bactérias ao microscópio de luz?

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Imagem em microscopia eletrônica de transmissão de vírions de Influenza A (Foto: CDC)

Os vírus são frequentemente chamados de  “o inimigo invisível”. Eles não são visíveis a olho nu, ou mesmo usando um microscópio óptico padrão. Então, como sabemos que eles existem ou como são?

Existem métodos bioquímicos, como os usados para confirmar a infecção por Covid-19, que buscam evidências do material genético de um vírus. Mas também existem vários métodos diferentes que usamos no laboratório para “ver” vírus.

Para entender esses métodos, primeiro precisamos compreender como os vírus realmente são pequenos. A maioria de nossas células tem cerca de 100 micrômetros (0,1 milímetro) de diâmetro. Os vírus são aproximadamente mil vezes menores do que essa média, em torno de 150 nanômetros (0,00015 milímetro).

1. Microscopia de luz

Os microscópios de luz padrão nos permitem ver nossas células claramente. No entanto, esses microscópios são limitados pela própria luz, pois não podem mostrar nada menor que a metade do comprimento de onda da luz visível — e os vírus são muito menores do que isso.

Células saudáveis de pulmão humano (esquerda) comparadas com células infectadas por vírus vistas em microscópio de luz padrão (magnificação 10x) (Foto: Grace Roberts/cedida pela autora)

Mas podemos usar microscópios para ver os danos que os vírus causam às nossas células. Chamamos isso de “efeito citopático”, e é comparando as células infectadas com as não infectadas que detectamos a presença de vírus em uma amostra.

Trabalhos preliminares sobre o Sars-CoV-2 (o vírus que causa a Covid-19), usando microscopia de luz, revelaram que o vírus é capaz de fundir células infectadas para formar sincícios — células grandes com múltiplos núcleos — um efeito que foi previamente observado em vários outros vírus respiratórios.

2. Imunofluorescência

Uma maneira indireta de visualizar os vírus é usar anticorpos (muito parecidos com os que o seu corpo produz em resposta a uma infecção) para marcar os vírus com moléculas fluorescentes que emitem luz quando absorvem certos tipos de radiação. Podemos até marcar várias coisas (como vírus e componentes celulares) com cores diferentes para que possamos rastrear mais de uma ao mesmo tempo.

Imagem de imunofluorescência mostra os cílios pulmonares (rosa), o núcleo da célula pulmonar (azul) e partículas de vírus (verde) (Foto: Grace Roberts/Cedido pela autora)

Podemos então detectar a luz fluorescente das marcas e ver para onde os vírus vão dentro de nossas células e com quais estruturas celulares eles interagem. Isso nos permite investigar, por exemplo, como as drogas afetam a replicação do vírus ou como diferentes cepas de vírus se comportam de maneira divergente.

3. Microscopia de super-resolução

Avanços recentes na microscopia fluorescente levaram ao desenvolvimento da microscopia de super-resolução, que combina física muito inteligente com métodos computacionais para produzir imagens claras que revelam estruturas altamente detalhadas nas células.

Núcleo da célula de câncer ósseos em alta resolução padrão de microscopia fluorescente (esquerda) e após processamento em super-resolução (direita) (Foto: Christoph Cremer/Wikimedia Commons, CC BY-SA)

Usar essa técnica para virologia pode localizar áreas de uma célula infectada com mais precisão. Por exemplo, pode mostrar exatamente onde os vírus estão situados dentro da célula e quais partes específicas do mecanismo celular os vírus usam para se replicar.

4. Microscópio eletrônico

Nenhuma das técnicas mencionadas até agora é capaz de visualizar diretamente as partículas virais. É aí que entra a microscopia eletrônica, pois ela pode produzir imagens em escala nanométrica. Ela faz isso disparando elétrons em uma amostra e vendo como eles interagem com ela. Um computador então interpreta essas informações para produzir uma imagem.

Visualização de microscopia de elétron de partículas do Sars-CoV-2, com aproximadamente 150-200 nanômetros de diâmetro. (Foto: Liu et al, CC BY-NC-ND)

Isso nos permite investigar visualmente os diferentes estágios da infecção do vírus dentro das células. A microscopia eletrônica também pode ser usada para visualizar partículas de vírus inteiras, como mostrado na imagem acima. A partir dessas imagens, podemos formar estruturas 3D de partículas de vírus inteiras por meio da montagem computacional de imagens de milhares de partículas tiradas em diferentes orientações, como este exemplo de uma renderização 3D EM [sigla em inglês para microscopia eletrônica] de Sars-CoV-2.

Morfologia estrutural do coronavírus (Foto: CDC/ Alissa Eckert, MSMI; Dan Higgins, MAMS)

A microscopia eletrônica foi usada no Sars-CoV-2 para determinar como o vírus usa sua proteína “injetora” externa para interagir com nossas células e infectá-las. Esses estudos são realmente úteis para descobrir como o vírus obtém acesso às nossas células, para que possamos descobrir como usar medicamentos e bloqueá-lo.

Avaliar a estrutura externa das partículas de vírus também é uma ótima ferramenta para identificar quais anticorpos podem neutralizar um vírus, o que pode ajudar a produzir vacinas mais precisas e eficazes.

5. Cristalografia

A cristalografia nos permite ver as estruturas com ainda mais detalhes, em nível atômico. Para fazer isso, você precisa de uma amostra realmente pura de vírus (sem resíduos) suspensa na solução. O líquido da suspensão é evaporado, o que provoca a cristalização dos sólidos remanescentes (incluindo o vírus). Estes se alinham de maneira uniforme para formar cristais que podem então ser expostos aos raios-X.

Raio-x em cristalografia da estrutura do capsídeo do vírus Norwalk (Foto: BV Prasad et al)

Um detector registra a maneira pela qual os raios-X difratam (ou "rebatem") na amostra cristalizada, indicando onde os elétrons estão na estrutura da amostra. Esta informação pode então ser usada para construir uma estrutura 3D em escala atômica da amostra.

Tal como acontece com a microscopia eletrônica, a cristalografia pode ser usada para determinar as estruturas dos vírus, como a proteína injetora do Sars-CoV-2. A compreensão dessas estruturas, especialmente como elas interagem com nossas células e anticorpos, informa a produção de vacinas e medicamentos.

*Grace C Roberts é pesquisadora em Virologia na Queen's University Belfast, na Irlanda do Norte. Texto originalmente publicado em inglês no site The Conversation

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